как получить эмбриональные стволовые клетки в домашних условиях?

усыпить беременную (срок 13-14 дней) ICR мышь с помощью CO2.
положить на спину и обработать 70% этанолом. используя ножницы, сделайте разрез на брюшке. осторожно вырежьте матку с помощью стерильных ножниц и пинцета, затем поместите в чашку петри со стерильными RBS.
отделите эмбрионы от матки, освободите эмбрионы от амниотического мешка, далее переместите эмбрионы во вторую чашку петри, содержащую стерильные RBS.
под препараторным микроскопом убрать от эмбрионов головы, печень, кишечник, сердце и все остальные внутренности используя два пинцета.
переместите туши эмбрионов в чистую чашу петри. осторожно нарубите эмбрион на мелкие кусочки стерильным скальпелем или ножницами (около 1x1 мм). добавьте 5.0 мл 0.25% трипсин/EDTA на каждые 10 плодов, соберите всё и перемешайте 10 мл пипеткой.
инкубировать смесь ткани 15 минут при 37°C, перемешивайте 3-4 раза с использованием 10 мл пипетки, чтобы отделить ткань. добавить равный объём полной среды MEF для деактивации трипсина.
энергично перемешать с помощью пипетки 10 мл.
поместить 1 эквивалент эмбрионного эквивалента в флакон для культур клеток T175 и добавить полную MEF среду, чтобы окончательный объём составил 30 мл на флакон.
эта плотность позволяет клеткам придерживаться, но не позволит им чрезмерно разливаться до сбора клеток через 3-4 дня.
инкубируют при температуре 37°C и 5% CO2.
(p.s. наши клетки называются мышиные эмбриональные фибробласты MEF.)
как правило, диссоциированные MEF прикрепляются к флакону и начинают делиться за ночь.
замените среду на следующий день с равным объёмом свежей и полной MEF среды.
через 3-4 дня, когда клетки становятся почти слившимися, MEF клетки готовы быть заморожены.
прополоскать клетки один раз свободным от CO2 + / Mg2 + раствором PBS.
ослабить прикрепившиеся клетки, используя 3 мл 0,05% трипсина/EDTA раствора на колбу. деактивируйте раствор трипсина, добавив 5 мл полной MEF среды.
собрать клетки из различных колб и подсчитать кол-во жизнеспособных клеток с использованием красителя трипанового синего или гемоцитометра.
жизнеспособность должна быть в пределах 95%-90%. центрифугируйте клеточную суспензию про комнатной температуре в течение 4 минут при 200 г. отберите среду, а клетки вновь разбавьте в полной среде при MEF 2x - желаемой конечной концентрации для замерзания. (т.е. 2.4x107 мл).
добавьте равный объём фетальной бычьей сыворотки с 20 DMSO, чтобы получить окончательную концентрацию 1x для хранения. разлить по 1 мл на криопробирку и заморозить. каждая пробирка содержит 1.2 x 107 MEF клеток.
заморозить клетки в криоконтейнере. контейнер хранится при комнатной температуре и заполнен 250 мл изопропанолом. приготовленные криопробирки помещаются в криоконтейнер, а он помещается в морозильник с -70° на ночь.
такая процедура обеспечивает охлаждение -1° в минуту, важный шаг чтобы сохранить жизнеспособность клеток. после одной ночи криопробирки убирают из криоконтейнера и помещают в жидкий азот (-196°C) для долгого хранения.
вы получили свои первые эмбриональные стволовын клетки! вы восхитительны, поздравляю!

миша мишенька медведь научи меня пердеть

верим?

чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка чечётка

сказала что то душеломательно мерзкое противоречащее божественному замыслу человеконенавистнеческое и меня опять из чата кикнули эх жалко они не выдержали даже день