#лабжурнал

Мы гибридизовали, гибридизовали, да не выгибридизовали

Привет, коллега!

Раз в предыдущем посте запросов на какие-то приборы и методы не было, расскажу про метод in situ HCR (Hybridization Chain Reaction). Обычно для определения экспрессии генов используется ПЦР, однако в этом случае оценка проводится для вообще всех клеток и мы получаем среднюю температуру по больнице с учётом морга. Можно предварительно отсортировать клетки и получить искомую популяцию, но большой риск, что за это время профиль экспрессии сильно изменится. Также можно сделать single-cell transcriptomics, но это для очень богатых лабораторий 🤱. Метод HCR подешевле и позволяет на гистологических срезах визуализировать экспрессию генов. Таком образом можно понять пространственное расположение синтеза отдельных мРНК, а также косвенно оценить величину экспрессии.

Протокол HCR весьма замороченный 😱, процедура занимает несколько дней и проводится в стерильных условиях, чтобы ни одна РНКаза не попала на образцы. У самой реакции можно выделить две стадии.

1️⃣ На первом этапе происходит связывание зондов (probe) с целевой последовательностью мРНК. Зонд предоставляет из себя комплементарную конкретному гену последовательность ДНК или РНК. В разных поколениях HCR он немного отличается. Самые первые зонды были связаны с нуклеотидной последовательностью-инициатором дальнейшей реакции. Но такая система давала много неспецифического сигнала. Затем систему зонд+инициатор стали делать в виде шпилек, которые раскрывались при совпадении с последовательностью. Это позволило убрать сигнал от несвязанных зондов, но не исключало неспецифического связывания с субстратом.

В третьем поколении HCR зондов два. Есть вариант, при котором каждый из зондов содержит половинку инициатора и только если они оба садятся на нужный ген - реакция запускается. Как вариант каждый зонд может содержать половину последовательности, к которой уже комплементарна цепочка, содержащая инициатор. Такая сложная система позволяет отсечь случайное связывание с нецелевыми генами, поскольку для инициации требуется связывание двух зондов.

2️⃣ После того как происходит связывание зонда с целевой РНК и инициатор становится открыт для взаимодействия, в систему добавляются так называемые шпильки: последовательности нуклеотидов, содержащие флуоресцентную метку. Шпилек два типа и они комплементарны, поэтому они залипают друг на друга, пока не закончатся. Это усиливает сигнал во много раз и мы можем детектировать его на флуоресцентном или конфокальном микроскопе. Важно, что шпильки можно использовать для разных генов, по сути они определяются последовательностью инициатора.

👍 В целом, метод топ за свои деньги, если продраться через протокол, то можно получить очень красивые и показательные изображения. Его любят зоологи и биологи развития, и делают в том числе и в России, вот, например, в этом году вышла статья у коллег. Ну и плюс HCR - относительно новая история, не успевшая всем надоесть, так что часто выводит статьи на новый методологический уровень, а значит, повышает шансы на публикацию в высокорейтинговом журнале 😉

#методичка

- Сколько нужно патентоведов, чтобы вкрутить лампочку?
- Один, но только если существует незапатентованный способ

Привет, коллега!

Как-то я делала подборку баз научных публикаций и мне не хватило символов, чтобы впихнуть туда ещё и базы патентов. Так что держи обещанный отдельный пост про то, где искать патенты.

🔘Google Patents. Куда же без гугла. Отличная платформа, включает как российские, так и зарубежные патенты. Можно добавить галочку на поиск в google scholar и одновременно искать не только патенты, но и статьи. Очень удобно, если хочешь быстренько прикинуть насколько твоя оригинальная и не изучил ли её кто-то другой.

🔘PATENTSCOPE глобальная база данных Всемирной организации интеллектуальной собственности. Здесь можно найти международные патенты, а также национальные патенты, в том числе и российские. Хотя с последними достаточно не густо, по моему запросу ничего отечественного не нашлось, хотя гугл справился и нашёл аж 19 патентов.

🔘Федеральный институт промышленной собственности (ФИПС) База российский патентов и заявок на патенты. Поисковая строка организована не очень удобно, но с поллитрой разобраться можно.

🔘Евразийское патентное ведомство. База патентов стран участниц евразийской патентной конвенции, а именно Азербайджана, Армении, Белоруссии, Казахстана, Кыргызстана, России, Таджикистана и Туркменистана. Есть бесплатный и платный доступ, но для поверхностного анализа гостевого режима вполне достаточно.

🔘Espacenet. Ещё одна база патентов со всего мира, на этот раз от Европейского патентного ведомства. Находит например китайские патенты на языке оригинала, а вот с российскими справляется не очень хорошо.

И вдогонку ещё несколько национальных патентных баз:

🔘Ведомство США по патентам и товарным знакам USPTO - база патентов США

🔘Японская платформа патентной информации J-PlatPat - база патентов Японии

🔘Корейская информационная служба по правам интеллектуальной собственности KIPRIS - база патентов Кореи

✏️ Сохраняй подборочку себе, чтобы не потерять. А пост сопровождает прекрасная кошечка Фелисити - хозяйка сразу двух моих подписчиков.

UPD: в комментариях подсказали еще
Яндекс.Патенты - сервису всего пять лет, но российские патенты ищет отлично, куда лучше гугла. Пишут, что внутри зашита база ФИПС, но поиск куда более дружелюбный

#годнота
Очень люблю канал Докторские байки, вчера вот порадовал интересным практикумом для студентов. Особый восторг вызывает то, что идея для молбиол прака пришла из опыта маринования шашлыков 🍢

Кстати, у меня похоже не набирается достаточно материала для регулярной рубрики #дендрофекальные_лайфхаки, слишком уж нас балуют новым оборудованием, но в Докторских байках можно найти очень много интересных решений для биохимической и молекулярной лаборатории 😉

#сдохни_или_умри

Мои вкусы очень специфичны

Привет, коллега!

В этом году я получила удовольствие от написания отчёта РНФ. В чём мой секрет? Амфетамин. На самом деле это первый грант, где я сама продумывала план работ, имея за плечами богатый опыт написания отчётов по чужим грантам.

У многих при написании заявок есть желание показать максимально крутую и насыщенную работу для того, чтобы гарантированно выиграть грант 🏋️‍♂️. Однако часто это влечёт за собой сложности в выполнении намеченного плана. То какой-то реагент снимают с производства или перестают поставлять. То срывается международное сотрудничество из-за различных операций. Какие-то эксперименты просто не получаются. А отчёт-то делать надо. И тогда приходится обосновывать, почему работа не была выполнена в заявленном объёме, почему вот эта публикация относится к теме проекта и почему мы меняем дальнейшие планы

Отдельный кайф, когда ты немного поменял план работ, в РНФ всё одобрили и ты нормально идёшь по новому курсу, но в финальном отчёте тебе обязательно припомнят всё из твоей заявки. Конечно, эксперты РНФ тоже люди и понимают, что есть объективные причины изменения планов, но я хорошо помню весь стресс, который испытывала группа при формировании отчёта 😵

В своей же заявке я постаралась максимально учесть предыдущий опыт и хорошо спланировать работу. Несмотря на то, что какие-то отдельные моменты не получились, я правда кайфовала. Каждое намеченное действие было так или иначе выполнено и мне не пришлось заниматься натягиванием пернатых на сферические предметы. И собственно, хочу дать несколько советов. Они не гарантируют того, что твоя заявка выиграет. Но по крайней мере позволят выжить, если она сделает это.

🟢 На 1 год планируй то, что ты можешь сделать без каких-либо новых реактивов и расходки. Если это отсутствует на складах и нужно покупать за границей - ты получишь всё только к концу отчётного периода. Моё соглашение с РНФ заключено в августе, в конце сентября я подала договор в отдел закупок, в начале ноября его подписали, а поставку я получила в апреле. Отчёт в мае 🤷‍♂️. Естественно, если бы наличие этих реактивов определяло выполнение проекта, ничего бы я не сделала. Поэтому на 1 год я спасалась имеющимися запасами, которые потом возместила уже с гранта. Если у тебя чего-то принципиально важного нет - подумай, у кого можно одолжить, например, чат Научной коммуны зачастую очень спасает. Ещё есть вариант, когда на 1 год прописывается та работа, которая уже сделана, но это не совсем честно.

🟢 Хорошо просчитай время каждого этапа и умножь его на 2. Затем умести это в календарный план. Если ты не знаешь, сколько выполняется та или иная работа - обязательно проконсультируйся с коллегами, не пиши наобум. Ещё бывает, ты заявляешь простейшую методику вроде ОТ-ПЦР, а потом выясняется что из твоих образцов плохо выделяется РНК. Если какой-то протокол еще не поставлен в лаборатории - заложи на него ещё больше времени и продумай, что ты будешь делать, если он не сработает.

🟢 Придумай тему каждой публикации заранее. На первый год лучше заявить поменьше, потому процесс, сам понимаешь, не быстрый. Если публикация нужна к концу отчётного периода, то лучше подавать её в самом начале. Я отправила статью по гранту в журнал в феврале и до сих пор она болтается на ревизиях 🙄. Мой личный антирекорд по скорости это 2 года. 2 года, Карл! Конечно, всегда есть MDPI с их быстрыми сроками рассмотрения и они явно спасли не один отчёт. Но и репутацию издательства мы тоже знаем.

🟢 Представь, что каждый из пунктов твоего плана пошёл не так. Что ты будешь с этим делать? Продумай план Б. Заодно ещё и план В и Г. За последние 6 лет я была одним из основных исполнителей по 4 большим грантам и в каждом что-то шло не так. Поверь, очень тяжело продумывать выходы, если поджимают сроки и отчет уже горит. Поэтому лучше оценить все риски на этапе планирования.

〰️〰️〰️〰️
Эти советы хоть просты и банальны, но не только лишь все ими пользуются. Уже сейчас можешь попробовать применить их при написании заявки на гранты из подборки.

#ля_ты_крыса

Берегите природу - вашу мать

Привет, коллега!

Испытания на лабораторных животных пока ещё являются неотъемлемой частью биомедицины. И я сейчас не про трудную жизнь аспирантов. Мышей, крыс, кроликов и других зверей используют для тестирования препаратов, изучения патогенеза различных заболеваний, для фундаментальных исследований и для студенческих практикумов. В разных странах есть свои нормы работы с лабораторными животными, но базой для всех них является принцип 3R, предложенный учёными Уильямом Расселом и Рексом Берчем в 1959 году в книге "Принципы гуманной экспериментальной техники". Вот о них будет сегодняшний пост.

🔤 Replacement (замена) - замена лабораторных животных альтернативными моделями или более низкоорганизованными видами. Сюда входит использование компьютерных моделей, культур клеток, органоидов, органов-на-чипе и других in vitro систем. В целом направление non-animal testing набирает популярность среди исследователей, есть даже целый журнал, публикующий альтернативные экспериментальные модели. Если такие модели не подходят, то стоит рассмотреть замену более примитивным организмами, например, рыбами или поклонниками инстасамки.

🔤 Reduction (уменьшение) - уменьшение количества используемых животных до минимального. Если уж приходится проводить эксперимент на животных, то по крайней мере необходимо оптимизировать дизайн исследования и статистический анализ так, чтобы извлечь максимум информации из минимального количества животных. В первую очередь это уменьшение разброса за счёт однородности выборки и стандартизации работы приборов. Биостатистики в фарм компаниях часто пользуются расчётом мощности критерия для определения минимально необходимого размера выборки. И в будущем я расскажу как это делается.

🔤 Refinement (улучшение) - улучшение условий содержания и уменьшение страданий от экспериментальных процедур. Животные должны содержаться в просторных клетках, с подходящим уровнем освещения, влажности, шума, с доступом к корму и воде - это всё у нас регламентируется ГОСТами (спасибо и на этом). Также важно обогащать среду их обитания: мышам можно класть втулки от туалетной бумаги, которые они используют как норы, для крыс подходят подвесные гамачки и домики, для свиней - собачьи игрушки. Большинство лабораторных животных социальные и очень страдают в отсутствии сородичей или интересной среды обитания. Кроме хомяков, хомяки - одинокие волки на одинокой волчьей дороге, хотя и им любопытство не чуждо

Помимо этого исследователь должен подбирать наименее инвазивные методики работы с животными, обязан использовать анестезию и анальгезию при болезненных вмешательствах. Кстати, препараты должны быть правильно подобраны, например, анальгин совершенно не действует на крыс (по некоторым данным на людей тоже). К сожалению, тут гос регламентов нет, так что лучше читать рекомендации.

Когда я проходила обучение работе с лабораторными животными в Швеции, я узнала про ещё одну, четвёртую R. Эта R, как мне кажется, в нашей стране должна выходить на первый план, с учётом ситуации по охране животных.

🔤 Responsibility (ответственность) - именно исследователь несёт ответственность за выполнение всех остальных R. Именно он должен подбирать альтернативные модели, высчитывать минимальную выборку и следить за благополучием животных. Я видела крыс, которых бросили в виварии с гниющими ранами без лечения и обезболивания. И никто не имел права подвергнуть животных гуманной эвтаназии, поскольку авторы эксперимента считали эту ситуацию нормальной, а законных способов прекратить это издевательство не было. Это ужасает и я очень надеюсь, что никто из читающих этот канал не позволит себе творить такое. Потому что благополучие твоих экспериментальных животных - это твоя ответственность.

〰️〰️〰️
Так что запоминай четыре простых правила и постарайся относиться к экспериментальным животным с состраданием и заботой. Конечно, в ближайшие годы мы никуда не уйдём от их использования, но по крайней мере мы можем сделать их жизнь чуть лучше.

#АДский_труд

Пришло мне тут на почту предложение опубликовать статью в журнале Archives of Clinical and Biomedical Research. Аж за 7-10 дней. А ещё и импакт написали - 3.1. Невероятное роскошество. Естественно, мне стало интересно в чём именно подстава такого прекрасного предложения и я полезла гуглить. Буквально на первой странице попала на топик, где расследование уже провели за меня. Пересказываю суть:

Во-первых, издательство входит в чёрный список хищнических издательств и журналов.

Во-вторых, по указанному контактному адресу никаких издательств нет.

В-третьих, несмотря на указанный импакт-фактор, журнал не индексируется в Clarivate (ex Web of Science), а именно они и считают классический импакт-фактор.

И наконец, в информации указано, что журнал индексируется в PubMed, однако это не так: там есть только статьи с грантовой поддержкой National Institutes of Health (NIH), которые в принципе обязаны быть в этой базе.

При этом стоимость публикации аж 3 тысячи долларов, хотя для бедных стран издательство готово сделать скидку 🙏

Так что вот так, быстрый сыр бывает только в сомнительных мышеловках. Внимательно проверяй журналы и их репутацию, прежде чем подавать в них статьи.

🔥 Пятница 13е на дворе, так что и традиционный интерактивчик будет тоже тематическим.

Скидывай в комментарии свои самые любимые фильмы ужасов/триллеры. Посмотрим, наберётся ли у нас фильмов для подборки, которую я опубликую уже на Хэллоуин

Лично мой рейтинг возглавляет фильм Нечто. Интересный факт: за саундтрек к нему Эннио Морриконе был номинирован на Золотую малину. Так что ты можешь быть гением в своём деле, но нечто всё равно может подпортить тебе резюме 😓

Статья вашей покорной слуги в этом списке тоже засветилась 🤬 Причём судя по данным сайта я, на тот момент бедный аспирант со стипендией 7 400, заплатила за неё потом и кровью 61 600, а вот последний автор, академик, получил соавторство всего за 39 200. Так что PI быть выгоднее со всех сторон.