#Troubleshooting
Resolution is the ratio of center-to-center separation between two peaks (the difference in retention times) to the average baseline widths of those peaks. Therefore, a decrease in resolution implies that either selectivity or peak width has changed.
Choose the one of the following which best describes the type of change which caused your resolution problem:
1. Selectivity and/or retention time changes
The retention time of one or more of your peaks is out of specification.
2. Abnormally wide peaks (abnormally low plate count)
The retention times and symmetries of all your peaks are within specification, but the width or plate count of one or more of your peaks is out of specification.
3. Peak shape problems
A. Tailing peaks
the retention times of all your peaks are within specification, but the peak symmetry (asymmetry factor or tailing factor) of one or more of your peaks is out of specification.
B. Peaks with shoulders
The retention times of all your peaks are within specification, but one or more of your peak shapes is abnormal in the form of a "shoulder."
C. Split peaks
one or more of your peaks is doubled or "split".
D. Flat-top peaks
the retention times of all your peaks are within specification, but one or more of your peak shapes is abnormal in the form of a "mesa" or "flat-topped" peak.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
Resolution is the ratio of center-to-center separation between two peaks (the difference in retention times) to the average baseline widths of those peaks. Therefore, a decrease in resolution implies that either selectivity or peak width has changed.
Choose the one of the following which best describes the type of change which caused your resolution problem:
1. Selectivity and/or retention time changes
The retention time of one or more of your peaks is out of specification.
2. Abnormally wide peaks (abnormally low plate count)
The retention times and symmetries of all your peaks are within specification, but the width or plate count of one or more of your peaks is out of specification.
3. Peak shape problems
A. Tailing peaks
the retention times of all your peaks are within specification, but the peak symmetry (asymmetry factor or tailing factor) of one or more of your peaks is out of specification.
B. Peaks with shoulders
The retention times of all your peaks are within specification, but one or more of your peak shapes is abnormal in the form of a "shoulder."
C. Split peaks
one or more of your peaks is doubled or "split".
D. Flat-top peaks
the retention times of all your peaks are within specification, but one or more of your peak shapes is abnormal in the form of a "mesa" or "flat-topped" peak.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
#Troubleshooting
اگر فقط برخی از پیک ها در کروماتوگرام به طور غیرعادی پهن هستند، در حالی که سایر پیک ها دارای عرض پیک مناسب هستند، باید احتمالات زیر را بررسی کنید:
1. غلظت بیش از حد نمونه(به خصوص اگر پیک های پهن دارای Area بزرگتر از پیک های باریک باشند).
2. فاز متحرک نادرست تهیه شده (به غلظت بافر و pH توجه ویژه داشته باشید).
3. تداخل نمونه ها اتفاق افتاده است.
4. تخریب نمونه رخ داده است.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
اگر فقط برخی از پیک ها در کروماتوگرام به طور غیرعادی پهن هستند، در حالی که سایر پیک ها دارای عرض پیک مناسب هستند، باید احتمالات زیر را بررسی کنید:
1. غلظت بیش از حد نمونه(به خصوص اگر پیک های پهن دارای Area بزرگتر از پیک های باریک باشند).
2. فاز متحرک نادرست تهیه شده (به غلظت بافر و pH توجه ویژه داشته باشید).
3. تداخل نمونه ها اتفاق افتاده است.
4. تخریب نمونه رخ داده است.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
Developing #SEC Methods
Part1:
اندازه منافذ ستون:
پارامترهایی مانند اندازه منافذ، ابعاد ستون، دما، سرعت جریان و فاز متحرک هنگام توسعه روشهای SEC مهم هستند زیرا بسیاری از این موارد میتوانند بر میزان شناساییشده تأثیر بگذارند.
انتخاب اندازه منافذ بهینه برای مولکول های مورد نظر شما بسیار مهم است. شما باید اطمینان حاصل کنید که مونومرها و دایمرهای پروتئین از نظر فیزیکی قادر به نفوذ در ساختار منافذ هستند تا جداسازی حاصل شود. یک قانون کلی این است که اندازه منافذ ستون باید سه برابر قطر مولکول های مورد نظر باشد.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
Part1:
اندازه منافذ ستون:
پارامترهایی مانند اندازه منافذ، ابعاد ستون، دما، سرعت جریان و فاز متحرک هنگام توسعه روشهای SEC مهم هستند زیرا بسیاری از این موارد میتوانند بر میزان شناساییشده تأثیر بگذارند.
انتخاب اندازه منافذ بهینه برای مولکول های مورد نظر شما بسیار مهم است. شما باید اطمینان حاصل کنید که مونومرها و دایمرهای پروتئین از نظر فیزیکی قادر به نفوذ در ساختار منافذ هستند تا جداسازی حاصل شود. یک قانون کلی این است که اندازه منافذ ستون باید سه برابر قطر مولکول های مورد نظر باشد.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
👍1
📚Ligand Exchange Chromatography (LEX):
1-Separation is based on differences in analytes coordination complex.
2-Stationary phase modified with metal sulfonate complex ion.
3-Works in combination with size exclusion or HILIC modes.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
1-Separation is based on differences in analytes coordination complex.
2-Stationary phase modified with metal sulfonate complex ion.
3-Works in combination with size exclusion or HILIC modes.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
HPLC #Troubleshooting:
#NoPeaks:
Possible cause:
Instrument failure,wrong elution condition.
Solution:
Does the detector show typical baseline noise? If the detector output is just a flat line,the detector or data transfer failed.
Inject known test substance without column and check detector response.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚@HPLCChannel
#NoPeaks:
Possible cause:
Instrument failure,wrong elution condition.
Solution:
Does the detector show typical baseline noise? If the detector output is just a flat line,the detector or data transfer failed.
Inject known test substance without column and check detector response.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚@HPLCChannel
📚Ion Exclusion Chromatography (IEX):
1-Separation is based on electrostatic interaction (repulsion) between the ion exchanger and ionic solutes.
2-Dissociated ionic molecules elute faster than non-dissociated forms.
3-Used mainly for the analysis of organic acids
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
1-Separation is based on electrostatic interaction (repulsion) between the ion exchanger and ionic solutes.
2-Dissociated ionic molecules elute faster than non-dissociated forms.
3-Used mainly for the analysis of organic acids
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
🚑#troubleshooting:
#Baseline #noise or #drift:
1-flow rate fluctuations .
2-air bubbles.
3-temperature fluctuations.
4-detector lamp problems (especially an aging lamp).
5-electrical/electronic problems (especially short-term noise)
6-misalignment of the detector cell (especially in gradient separations).
7-UV absorbance mismatch between solvents.
8-contamination of the mobile phase.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
#Baseline #noise or #drift:
1-flow rate fluctuations .
2-air bubbles.
3-temperature fluctuations.
4-detector lamp problems (especially an aging lamp).
5-electrical/electronic problems (especially short-term noise)
6-misalignment of the detector cell (especially in gradient separations).
7-UV absorbance mismatch between solvents.
8-contamination of the mobile phase.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
📚Size Exclusion Chromatography (SEC):
1-Network or pores on the surface of the packing material works as molecular sieve to separate molecules based on their sizes.
2-To separate molecules solely based on their sizes, it requires an analytical condition without any analyte and packing gel interaction.
3-The bigger the molecule size, the faster the elution sequence.
4-Used for molecular weight or molecular distribution determination of macromolecules and qualification of oligomers.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
1-Network or pores on the surface of the packing material works as molecular sieve to separate molecules based on their sizes.
2-To separate molecules solely based on their sizes, it requires an analytical condition without any analyte and packing gel interaction.
3-The bigger the molecule size, the faster the elution sequence.
4-Used for molecular weight or molecular distribution determination of macromolecules and qualification of oligomers.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
👍1
📚Ion Exchange Chromatography (IEC:
1-Separation is based on electrostatic interactions between the ion exchanger and ionic solutes.
2-The mobile phase of choice should have a sufficient buffering capacity at the pH that produces the largest charge differences between the analyte of interest .
3-The elution position is optimized by varying the pH, salt concentration, and/or ionic strength of the mobile phase.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
1-Separation is based on electrostatic interactions between the ion exchanger and ionic solutes.
2-The mobile phase of choice should have a sufficient buffering capacity at the pH that produces the largest charge differences between the analyte of interest .
3-The elution position is optimized by varying the pH, salt concentration, and/or ionic strength of the mobile phase.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
Size-exclusion chromatography is used mainly to separate........
Anonymous Poll
18%
Polar compounds
9%
Non polar compounds
9%
Aromatic compounds
82%
high-molecular weight compounds
📚مشکل وجود فشار برگشتی بیش از حد
اگر فشار برگشتی سیستم شما از حالت عادی بیشتر است، اولین چیزی که باید بررسی کنید تنظیم سرعت جریان پمپ میباشد. اگر سرعت جریان صحیح باشد، باید آماده سازی فاز متحرک را بررسی کنید.در اغلب موارد، آمادهسازی نادرست فاز متحرک به تغییر در زمان بازداری و انتخاب پذیری می انجامد.
اگر شروع فشار برگشتی بیش از حد 'فاجعه بار' است(یعنی فشار بسیار بالاتر از حد توان سیستم و تجهیزات است) و همچنین'ناگهانی' باشد، علت احتمالی در سیستم انتقال می باشد(چک ولو،تیوپ،اتصالات). در بیشتر موارد، این فشار برگشتی به حدی زیاد است که باعث خاموش شدن پمپ میشود. در این حالت ابتدا اتصالات انتهای سیستم را بررسی کنید و این کار را به سمت ابتدای سیستم ادامه دهید (مثلاً در: خروجی آشکارساز، خروجی ستون، ورودی ستون، خروجی گارد ستون، ...) هنگامی که فشار ناگهان به حالت عادی کاهش یافت، شما منبع مشکل را دقیقاً در آخرین اتصالی که شل کردهاید مشخص کردهاید.
اگر شروع فشار برگشتی بیش از حد تدریجی بود(کم کم فشار زیاد شد) دلایل احتمالی شامل مسدود شدن سر ستون و ورودی ستون ویا آلودگی/فاسد شدن ستون است. به سادگی با شستشوی بلعکس ستون با استفاده از فاز متحرک مناسب و سرعت جریان استاندارد این مشکل برطرف می شود(ستون را معکوس کنید) دومی(آلودگی/فاسد شدن ستون) به طور کلی نیاز به جایگزینی ستون دارد.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
اگر فشار برگشتی سیستم شما از حالت عادی بیشتر است، اولین چیزی که باید بررسی کنید تنظیم سرعت جریان پمپ میباشد. اگر سرعت جریان صحیح باشد، باید آماده سازی فاز متحرک را بررسی کنید.در اغلب موارد، آمادهسازی نادرست فاز متحرک به تغییر در زمان بازداری و انتخاب پذیری می انجامد.
اگر شروع فشار برگشتی بیش از حد 'فاجعه بار' است(یعنی فشار بسیار بالاتر از حد توان سیستم و تجهیزات است) و همچنین'ناگهانی' باشد، علت احتمالی در سیستم انتقال می باشد(چک ولو،تیوپ،اتصالات). در بیشتر موارد، این فشار برگشتی به حدی زیاد است که باعث خاموش شدن پمپ میشود. در این حالت ابتدا اتصالات انتهای سیستم را بررسی کنید و این کار را به سمت ابتدای سیستم ادامه دهید (مثلاً در: خروجی آشکارساز، خروجی ستون، ورودی ستون، خروجی گارد ستون، ...) هنگامی که فشار ناگهان به حالت عادی کاهش یافت، شما منبع مشکل را دقیقاً در آخرین اتصالی که شل کردهاید مشخص کردهاید.
اگر شروع فشار برگشتی بیش از حد تدریجی بود(کم کم فشار زیاد شد) دلایل احتمالی شامل مسدود شدن سر ستون و ورودی ستون ویا آلودگی/فاسد شدن ستون است. به سادگی با شستشوی بلعکس ستون با استفاده از فاز متحرک مناسب و سرعت جریان استاندارد این مشکل برطرف می شود(ستون را معکوس کنید) دومی(آلودگی/فاسد شدن ستون) به طور کلی نیاز به جایگزینی ستون دارد.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
👍2
📚Excessive pressure problem
If your system back pressure exceed system suitability, the first thing to check is the pump flow rate setting. If this is correct, then check to confirm that the mobile phase was correctly prepared. In most cases, incorrect mobile phase preparation will be accompanied by a change in retention or selectivity.
If the onset of excessive back pressure was "catastrophic" (i.e., a pressure well above system suitability or even equipment limits) and "abrupt," the most likely cause is a plug in a transfer line, valve, or other flow passage. In most cases, this will be sufficiently high to trigger pump shut-down. In this case, start disconnecting connections from the end of the system and continue moving upstream (e.g., disconnect at: detector outlet, column outlet, column inlet, guard column outlet . . .). When the pressure suddenly drops back down to normal, you have pinpointed the source of the problem as just downstream from the last connection you loosened.
If the onset of excessive back pressure was gradual, possible causes include plugging of the inlet frit/column head and contamination/deterioration of the column. The former can often be remedied by simply back-flushing the column; use your standard mobile phase and flow rate, but reverse the column. The latter generally requires replacement of the column.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
If your system back pressure exceed system suitability, the first thing to check is the pump flow rate setting. If this is correct, then check to confirm that the mobile phase was correctly prepared. In most cases, incorrect mobile phase preparation will be accompanied by a change in retention or selectivity.
If the onset of excessive back pressure was "catastrophic" (i.e., a pressure well above system suitability or even equipment limits) and "abrupt," the most likely cause is a plug in a transfer line, valve, or other flow passage. In most cases, this will be sufficiently high to trigger pump shut-down. In this case, start disconnecting connections from the end of the system and continue moving upstream (e.g., disconnect at: detector outlet, column outlet, column inlet, guard column outlet . . .). When the pressure suddenly drops back down to normal, you have pinpointed the source of the problem as just downstream from the last connection you loosened.
If the onset of excessive back pressure was gradual, possible causes include plugging of the inlet frit/column head and contamination/deterioration of the column. The former can often be remedied by simply back-flushing the column; use your standard mobile phase and flow rate, but reverse the column. The latter generally requires replacement of the column.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
#Troubleshooting
تفکیک پذیری: نسبت فاصله مرکز به مرکز بین دو پیک (تفاوت در زمان بازداری) به میانگین عرض خط پایه آن پیک ها را گویند. بنابراین، کاهش تفکیک پذیری بیانگر این است که گزینش پذیری یا عرض پیک تغییر کرده است.
یکی از موارد زیر را انتخاب کنید که به بهترین شکل علتی که باعث ایجاد مشکل در تفکیک پذیری پیک های شما می باشد را توصیف می کند:
1-تغییر گزینش پذیری یا زمان بازداری
زمان بازداری یک یا چند پیک شما خارج از محدوده مورد انتظار می باشد.
2- پیک های عریض غیرعادی (تعداد بشقابک های فرضی غیرعادی کم است)
زمانهای بازداری و تقارن همه پیک های شما مطابق با مشخصات است، اما عرض یا تعداد بشقابک های فرضی یک یا چند پیک شما خارج از محدوده مورد انتظار است.
3-مشکلات شکل ظاهری پیک
الف. دنباله دار بودن پیک ها
زمانهای بازداری همه پیک های شما در حد محدوده مورد انتظار است، اما تقارن پیک (ضریب عدم تقارن یا دنباله دار بودن پیک) یک یا چند پیک شما خارج از حد محدوده مورد انتظار است..
ب. پیک هایی شانه دار
زمانهای بازداری همه پیک های شما در حد محدوده مورد انتظار است ، اما یک یا چند شکل پیک شما به شکل یک 'شانه' غیر طبیعی است.
ج. پیک های دو شاخه
یک یا چند پیک شما دو شاخه شده یا 'شکافته' شده است.
د. پیک های که بالای آنها تخت می باشد
زمانهای بازداری همه پیک های شما در حد محدوده مورد انتظار است ، اما یک یا چند شکل پیک شما به شکل 'روی صاف' غیرعادی است.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
تفکیک پذیری: نسبت فاصله مرکز به مرکز بین دو پیک (تفاوت در زمان بازداری) به میانگین عرض خط پایه آن پیک ها را گویند. بنابراین، کاهش تفکیک پذیری بیانگر این است که گزینش پذیری یا عرض پیک تغییر کرده است.
یکی از موارد زیر را انتخاب کنید که به بهترین شکل علتی که باعث ایجاد مشکل در تفکیک پذیری پیک های شما می باشد را توصیف می کند:
1-تغییر گزینش پذیری یا زمان بازداری
زمان بازداری یک یا چند پیک شما خارج از محدوده مورد انتظار می باشد.
2- پیک های عریض غیرعادی (تعداد بشقابک های فرضی غیرعادی کم است)
زمانهای بازداری و تقارن همه پیک های شما مطابق با مشخصات است، اما عرض یا تعداد بشقابک های فرضی یک یا چند پیک شما خارج از محدوده مورد انتظار است.
3-مشکلات شکل ظاهری پیک
الف. دنباله دار بودن پیک ها
زمانهای بازداری همه پیک های شما در حد محدوده مورد انتظار است، اما تقارن پیک (ضریب عدم تقارن یا دنباله دار بودن پیک) یک یا چند پیک شما خارج از حد محدوده مورد انتظار است..
ب. پیک هایی شانه دار
زمانهای بازداری همه پیک های شما در حد محدوده مورد انتظار است ، اما یک یا چند شکل پیک شما به شکل یک 'شانه' غیر طبیعی است.
ج. پیک های دو شاخه
یک یا چند پیک شما دو شاخه شده یا 'شکافته' شده است.
د. پیک های که بالای آنها تخت می باشد
زمانهای بازداری همه پیک های شما در حد محدوده مورد انتظار است ، اما یک یا چند شکل پیک شما به شکل 'روی صاف' غیرعادی است.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
❤1👍1
Number of theoretical plates (N), also known as efficiency in HPLC and calculated by using the following equation: N=5.54*(tr)²/(W50%)².
The N values reported here take into account the column efficiency as well as the loss in efficiency due to the chromatographic system (extra-column volume) and nature of the sample diluent.
The number of theoretical plate has not physical meaning in gradient mode; therefore N values will only appear in isocratic mode.
تعداد بشقابک های فرضی (N)، که به عنوان کارایی ستون نیز شناخته می شود با استفاده از معادله زیر محاسبه می شود
N = 5.54 * (tr) ² / (W50٪) ²
مقادیر N گزارش شده در اینجا به عنوان بازده ستون می باشد و کاهش این بازده میتواند بعلت شرایط سیستم HPLC و ماهیت رقیق کننده نمونه، نیز باشد.
تعداد بشقابک های فرضی معنای و مفهومی در حالت گرادیان ندارد؛ بنابراین ارزش N تنها در حالت ایزوکراتیک مطرح می شود.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
The N values reported here take into account the column efficiency as well as the loss in efficiency due to the chromatographic system (extra-column volume) and nature of the sample diluent.
The number of theoretical plate has not physical meaning in gradient mode; therefore N values will only appear in isocratic mode.
تعداد بشقابک های فرضی (N)، که به عنوان کارایی ستون نیز شناخته می شود با استفاده از معادله زیر محاسبه می شود
N = 5.54 * (tr) ² / (W50٪) ²
مقادیر N گزارش شده در اینجا به عنوان بازده ستون می باشد و کاهش این بازده میتواند بعلت شرایط سیستم HPLC و ماهیت رقیق کننده نمونه، نیز باشد.
تعداد بشقابک های فرضی معنای و مفهومی در حالت گرادیان ندارد؛ بنابراین ارزش N تنها در حالت ایزوکراتیک مطرح می شود.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
Forwarded from HPLC Channel (HPLC Admin)
📚 HPLC Columns
📖 Theory, Technology, and Practice
🖊 Edition: 1sd Edition
✏️Author: Uwe D. Neue
🗳 ISBN: 978-0471190370
🔖 Copyright: 1997
📖 Hardcover: 416 Pages
👇👇👇👇👇👇👇👇👇
📖 Theory, Technology, and Practice
🖊 Edition: 1sd Edition
✏️Author: Uwe D. Neue
🗳 ISBN: 978-0471190370
🔖 Copyright: 1997
📖 Hardcover: 416 Pages
👇👇👇👇👇👇👇👇👇
👍1👏1
Forwarded from HPLC Channel (HPLC Admin)
HPLC Columns_ Theory, Technology, and Practice (1997).djvu
3.5 MB
✅ Description:
An in-depth guide to HPLC column technology High-performance liquid chromatography and its derivative techniques have become the dominant analytical separation tools in the pharmaceutical, chemical, and food industries; environmental laboratories; and therapeutic drug monitoring. Although the column is the heart of the HPLC instrument and essential to its success, until now, no book has focused on the theory and practice of column technology.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
📚 @HPLCTraining
پیچ اینستاگرام:
📚 https://instagram.com/hplc_training?igshid=YWJhMjlhZTc=
An in-depth guide to HPLC column technology High-performance liquid chromatography and its derivative techniques have become the dominant analytical separation tools in the pharmaceutical, chemical, and food industries; environmental laboratories; and therapeutic drug monitoring. Although the column is the heart of the HPLC instrument and essential to its success, until now, no book has focused on the theory and practice of column technology.
┄┅••●👇JOIN👇●••┅┄
📚 @HPLCChannel
📚 @HPLCTraining
پیچ اینستاگرام:
📚 https://instagram.com/hplc_training?igshid=YWJhMjlhZTc=
👍1👏1